Трансплантация эмбрионов крупного рогатого скота

1. Отбор коров доноров. Первой ступенью в реализации метода трансплантации эмбрионов является отбор коров доноров. Специалисты, работающие с крупным рогатым скотом,  расходятся во мнениях относительно критериев отбора генетически выдающихся коров.

Однако, большинство сходится во мнении, что главным критерием должна быть потенциальная стоимость полученных телят. Как мы увидим позже, для достижения успешной пересадки эмбриона и получения беременности необходимы значительные расходы.

Таким образом, цена продажи новорожденного теленка-трансплантанта должна быть достаточно высокой, чтобы оправдать дополнительные затраты на эту процедуру. Выбор донора среди молочного скота является более лёгким благодаря оценке его молочной продуктивности в сравнении с мясным скотом.

Однако, трансплантация эмбрионов не является панацеей решающей все проблемы. Это не сделает средний скот хорошим и хороший скот лучшим. Метод трансплантации подходит для ограниченного количества особей мясного или молочного скота, которые могут стать улучшателями породы по одному или более экономически важным признакам.

2. Суперовуляция коров доноров. Вызывание суперовуляции у коров это следующая ступень в процессе пересадки эмбрионов. Под суперовуляцией понимается выделение множества яйцеклеток из яичников коровы в течение одной течки. Подвергнутая соответствующей гормональной обработке корова или тёлка способна выделить до 10 и более жизнеспособных яйцеклеток за одну течку.

Приблизительно 85% доноров с нормальной воспроизводительной способностью отреагируют на гормональную суперовуляционную обработку в среднем пятью пригодными для трансплантации эмбрионами. Некоторые коровы при повторных суперовуляционных обработках с 60-дневными перерывами могут иметь незначительное снижение количества зародышей с течением времени.

Основной принцип суперовуляции состоит в стимулировании роста фолликулов яичника с использованием гормональных препаратов с фолликул стимулирующей активностью. Препараты с фолликул стимулирующей активностью вводятся корове два раза в сутки на протяжении 4х дней во вторую половину эстрального цикла, в период функциональной активности жёлтого тела яичника.

На третий день обработки фолликул стимулирующим гормоном корове инъецируют простагландин, который вызывает рассасывание жёлтого тела и проявление течки приблизительно через 48 — 60 часов после инъекции.

3. Осеменение коров. При суперовуляции из множества фолликулов яичника выделяется множество яйцеклеток, на много больше, чем при обычной течке и в данной ситуации нужно быть уверенным в том, что достаточное количество жизнеспособных спермиев достигнет места оплодотворения в яйцеводах самки.

Поэтому многие специалисты по трансплантации эмбрионов практикуют несколько осеменений в течении течки при осеменении доноров. Одна из эффективных схем включает в себя осеменение коров доноров через 12, 24 и 36 часов после начала охоты.

Использование семени высокого качества с высоким процентом нормальных, подвижных спермиев является крайне важным моментом в процессе эмбриотрансплантации. При этом наиболее оптимальным местом введения семени является тело матки. Тело матки представляет собой небольшой участок половых путей коровы, расположенный сразу перед шейкой. Когда семя вводится глубоко в один из рогов матки, то оплодотворяемость может снизиться, если овуляция происходит на противоположном яичнике.

4. Вымывание эмбрионов. Сбор эмбрионов нехирургическим методом осуществляется с помощь резинового катетера, который вводится через шейку матки коровы донора. Через этот катетер в полость матки вводится специальная жидкая физиологическая среда и затем откачивается обратно вместе с эмбрионами.

Вымывание эмбрионов осуществляется обычно на 7-8 день после осеменения донора. Эта процедура сбора эмбрионов относительно проста и может быть проведена в течение 30 минут и даже быстрее, без причинения вреда животному.

Стерильный стилет помещается в просвет катетера для придания ему жесткости при прохождении через шейку матки в тело матки. Когда кончик катетера находится в теле матки, манжета медленно заполняется примерно 2 мл физиологического раствора.

Затем катетер аккуратно вытаскивается так, чтобы манжета располагалась в внутри канала шейки матки. Затем в манжету подаётся дополнительно жидкость, чтобы полностью уплотнить наружную стенку катетера с внутреннего стенкой канала шейки матки.

Далее с наружного конца катетера крепится Y-образный разъем с трубками для притока и оттока жидкости. К каждой из трубок крепится зажим для регулировки потока промывочной жидкости. При этом жидкость последовательно добавляется и удаляется самотёком под действием силы тяжести (по методу капельницы).

Жидкость в полости матки перемешивают рукой через стенку прямой кишки, особенное внимание уделяется верхней трети рога матки. Когда рог матки заполняется жидкостью для вымывания эмбрионов, то он имеет объём как при 40-дневной стельности.

На каждого донора затрачивается 1 литр жидкости для вымывания. Некоторые операторы используют меньший объем и промывают один рог матки за один раз. Каждый рог матки заполняется и опорожняется от пяти до десяти раз с 30 — 200 мл жидкости каждый раз, в зависимости от размера матки. Жидкость вместе с вымытыми эмбрионами помещается в большой мерный цилиндр.

Примерно через 30 минут, эмбрионы оседают на дне цилиндра и после слива верхних слоёв жидкости могут быть помещены под стереомикроскоп для выделения и оценки.

5. Оценка эмбрионов. Когда отдельные эмбрионы обнаруживаются под микроскопом, они проходят оценку по 4-х бальной шкале, чтобы иметь вероятность успеха при пересадке их самке-реципиенту. Для оценки эмбрионов используются следующие основные критерии:

— форма эмбриона;

— компактность бластомеров (делящихся клеток) внутри сферы эмбриона;

— различие размера бластомеров;

— цвет и структура цитоплазмы (жидкости внутри клеток) бластомеров;

— внешний диаметр эмбриона;

— наличие неразвитых или мёртвых бластомеров;

— целостность и форма зоны защитного белково-полисахаридного слоя окружающего одноклеточный эмбрион;

— наличие пузырьковидных образований в цитоплазме бластомеров.

В соответствии с этими критериями эмбрионы оцениваются как:

1-й класс — отличного и хорошего качества;

2-й класс — удовлетворительного качества;

3-й класс – плохого качества;

4-й класс – мёртвые и дегенерированные эмбрионы.

Кроме того эмбрионы оценивают по стадии развития, каждая из которых, также имеет номер:

1 стадия – неоплодотворённая яйцеклетка;

2 стадия – от 2 до 12 бластомеров;

3 стадия — ранняя морула;

4 стадия – морула;

5 стадия – ранняя бластоциста;

6 стадия – бластоциста;

7 стадия – расширенная бластоциста;

8 стадия – вылупившаяся бластоциста;

9 стадия – расширенная вылупившаяся бластоциста.

Не обнаружено значительной разницы по уровню стельности при пересадке эмбрионов разных стадий развития при условии, что реципиенты будут находиться в соответствующей стадии эстрального цикла. Эмбрионы 4,5 и 6 стадий развития после прохождения процессов заморозки и оттаивания сохраняют наибольшую жизнеспособность.

Качество эмбриона также имеет огромное значение для выживания после процедуры замораживания и оттаивания. Считается, что для замораживания пригодны только эмбрионы 1 класса. Эмбрионы 2 класса также могут быть подвержены заморозке, но уровень стельности при пересадке таких эмбрионов, как правило, снижается.

6. Отбор и подготовка самок-реципиентов.

Правильный менеджмент в стаде реципиентов является ключевым звеном для успешной пересадки эмбрионов. Коровы, которые не имеют проблем с воспроизводством, и у которых наблюдался лёгкий отёл – являются подходящими реципиентами. Для них должен быть подобран специальный рацион, что бы обеспечить упитанность тела 6 баллов для мясного скота и 3-4 балла для молочного скота.

Эти коровы также должны происходить из здорового стада. Возникает вопрос: «Сколько нужно реципиентов?». Установить среднее число эмбриопересадок на одного донора в год довольно сложно. Различия могут быть большими, но если производить вымывание эмбрионов у донора каждые 90 дней в течение года с результатом 5 стельностей на вымывание, то в течение года можно получить 20 стельностей на одного донора. Некоторые коровы доноры могут давать до 50 стельностей в год.

Для получения максимальной приживаемости эмбрионов при пересадке, состояние репродуктивного тракта реципиента должно, как можно точнее соответствовать состоянию репродуктивного тракта донора: необходимо синхронизировать половой цикл у донора и реципиента одновременно.

Для этого обычно используется инъекция препаратов простагландина. Этот прием повышает вероятность того, что в период эмбриотрансплантации реципиент будет находиться в той же стадии полового цикла, что и донор. В период проявления течки и охоты коровы доноры должны быть осеменены. Обычно пересадка эмбрионов реципиенту производиться на седьмой день после осеменения донора.

Метод синхронизации будет эффективен у животных имеющих нормальную половую цикличность. Коровы или тёлки не проявляющие половой цикличности, а также очень худые или очень жирные, или имеющие короткий период после отёла (менее 1,5 месяцев) не должны использоваться в качестве реципиентов.

7.      Пересадка эмбрионов. Первое что необходимо, для осуществления пересадки эмбриона реципиенту, это поместить эмбрион в соломинку для искусственного осеменения. Эта операция осуществляется под наблюдением через микроскоп с помощью шприца объёмом в 1 мл. Для этого необходимо иметь некоторую практику, терпение и сноровку.

Дегенерированные эмбрионы и эмбрионы плохого качества не должны использоваться для трансплантации. Непосредственно перед пересадкой эмбриона яичники реципиента пальпируются ректально для определения места овуляции.

Инструмент для пересадки эмбрионов вводиться также как при искусственном осеменении в шейку матки реципиента. Затем кончик инструмента продвигается в рог матки, на стороне которого в яичнике произошла овуляция. При этом нужно действовать очень аккуратно, чтобы не повредить слизистую оболочку рога матки. Затем надавливая на поршень шприца для трансплантации, эмбрион выталкивается из соломинки в полость рога матки. Затем инструмент также аккуратно выводится из половых путей.

Необходимо помнить, что повреждение или травмирование слизистой оболочки матки может заметно сократить приживаемость эмбриона. Для того чтобы сократить риск травмирования слизистой оболочки матки процессы вымывания и пересадки эмбрионов осуществляются после проведения эпидуральной анестезии, которая позволяет блокировать сокращение прямой кишки.

Эмбрионы могут быть пересажены сразу после их извлечения от донора и оценки, или могут быть заморожены и оставлены на хранение в жидком азоте до следующей пересадки. Процессы заморозки и оттаивания очень сложные и не безопасные для жизнеспособности эмбриона, и поэтому результаты стельности от пересадки замороженных эмбрионов бывают обычно ниже на 10-20% по сравнению с результатами от пересадки свежих эмбрионов.

Замороженные эмбрионы должны быть соответствующим образом промаркированы. Часто они используются для продажи.

8.      Стоимость эмбриопересадки. Стоимость эмбриопересадки может колебаться в зависимости от множества факторов. Некоторые специалисты по эмбриопересадкам производят трансплантацию только на тех фермах, где расположен донор.

Некоторые специалисты имеют возможности для транспортировки и размещения доноров и реципиентов на специально оборудованном пункте-лаборатории. Многие специалисты имеют оснащение и опыт заморозки эмбрионов для их последующего хранения или отправки в другие места.

Минимальная стоимость стельности от пересадки эмбриона составляет 250 долларов. Эта стоимость может не включать затраты на вызывание суперовуляции, и конечно затраты на осеменение, регистрацию и выдачу сертификата трансплантации, определение генетической принадлежности животных и др.

Три — пять соломинок высокоценного семени может стоить от 45-500 долларов. Соответствующее питание, поддержание здоровья, а также синхронизация донора и реципиента могут также повысить стоимость каждой успешной эмбриопересадки. Поэтому стоимость телёнка полученного от эмбриопересадки будет значительно выше, чем от осеменения. Но и отдача от животных полученных методом эмбриотрансплантации (в плане продуктивности), также может быть велика.